БАКТЕРІАЛЬНА ЦЕЛЮЛОЗА

Юлія Удовенко
дослідниця-мікробіологиня
Цукри, що містять 6 атомів вуглецю, як, наприклад, глюкоза.
Потенційні організми-продуценти

Науці відомий цілий ряд мікроорганізмів зі здатністю синтезу целюлозних волокон. Так, у ряді наукових праць грам-позитивні (Sarcina ventriculi) та грам-негативні бактерії з родів Agrobacterium, Aerobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Azotobacter, Rhizobium, Pseudomonas, Sarcina, Salmonella, Acetobacter та Komagataeibacter були названі організмами зі здатністю синтезу целюлозних волокон [1], [2]. Серед вказаних організмів найбільш ефективними вважаються бактерії роду Acetobacter (A.hansenii, A.pasterianus) та Komagataeibacter (K.xylinus) [3].


Хімічна складова: механізм синтезу

Молекулярний механізм виробництва целюлози ретельно вивчався на прикладі Komagateibacter xylinus – паличкоподібної аеробної бактерії, яка негативно забарвлюється за Грамом. Саме цей організм в таких дослідженнях став модельним (неначе дрозофіли у дослідах Моргана) [4].

Сам синтез бактеріальної целюлози – це надзвичайно точний та специфічно регульований багатоступінчастий процес. Він охоплює велику кількість індивідуальних ферментів, комплексів каталітичних та регуляторних білків [5].


Реакції біосинтезу проходять у наступному порядку:

- фосфорилізація (процес приєднання фосфатних груп з молекул АТФ) глюкози глюкозокіназою; [6].

- ізомеризація глюкозо-6-фосфату (Glc-6-P) фосфоглюкомутазою у глюкозо-1-фосфат (Glc-1-P)

- синтез уридіндифосфатглюкози (UDPGlc) за участю UDPGlc-пірофосфорилази

- формування целюлозних ланцюгів целюлозосинтазою.

- кінцевий етап – екструдування (буквально – «виштовхування») целюлозних ланцюгів із клітини та їхнє збирання у фібрили [7].


Підсумуємо: до глюкози (або іншого джерела Карбону) додаються фосфатні групи, внаслідок чого сполука дещо змінює свою структуру. Потім з неї синтезується попередник целюлози (UDPGlc), який потім перетворюється на кінцевий продукт (целюлозу) завдяки целюлозосинтазному комплексу.

Наочно увесь процес проілюстрований на рис.1:
Рис.1. Ферментативні перетворення глюкози у організмі K.xylinus
// Юлія Удовенко ©️
Проте, звідки організм бере фосфорильовані гексози (*)? Було виявлено, що в організмах існує певний метаболічний пул з гексозофосфатів, який підтримується безпосередньо завдяки фосфорилюванню екзогенних гексоз та опосередковано – через пентозний цикл і глюконеогенез (метаболічний шлях утворення глюкози з нецукрових вуглецевих субстратів). Саме перетворення гексозофосфату в целюлозу є прямим, оскільки у процесі ізомеризації не розривається карбоновий ланцюг [8], [9].

Виходячи з цього, стає зрозумілим, чому у розчин для культивування M. gisevii ми додавали сахарозу (вона гідролізується до глюкози, яка далі бере участь у вказаних реакціях). А також зрозуміло, яким чином з уридіндифосфатглюкози утворюється те, що ми називаємо бактеріальною целюлозою.
Целюлозна плівка, утворена K.xylinus після культивування протягом 24 годин при температурі 30°C // P. Ross, R. Mayer and M. Benziman, M., "Cellulose Biosynthesis and Function in Bacteria", Microbiological Reviews 55, no. 1 (1991): 50-53.
Біологічна складова


Якщо з суто хімічного боку процес зрозумілий, то біологічний сенс цих перетворень дещо складніший. Бактеріальна целюлоза виконує структурну роль, бо може слугувати механічним, хімічним та біологічним захистом (K.xylinus, S.verticuli). Вона також полегшує адгезію клітин, яка необхідна для симбіотичних відносин (види Rhizobium та Agrobacterium) [10]. Для отримання більш повної картини, познайомимось із продуцентами ближче.

• Колонії K.xylinus. У статичній культурі легко утворюють видиму плівку з целюлози, яка покриває поверхню поживного середовища. Коли культуру перемішують, організми починають рости інтенсивніше завдяки підвищеному рівню аерації. Проте за таких умов утворюється не рівномірний шар целюлози, а щось на кшталт целюлозних «кульок» [11]. При цьому зазначають, що швидкість формування екзополісахариду залежить навіть не від виду, а від штамів [12].

Ймовірно, біологічна мета формування целюлози – забезпечення твердої поверхні, на якій «вбудовані» клітини-аероби можуть отримувати вигоду від тісного контакту з атмосферою [13]. Целюлозна плівка також може слугувати захистом від ультрафіолетового випромінювання. Таким чином, цей полісахарид відіграє декілька функцій у процесі росту та виживання організму.

Цікаво, що аерація штамів K.xylinus підвищує кількість організмів із фенотипом Cel-, які не синтезують целлюлозу [14]. Ці організми, потрапляючи у статичні умови, можуть змінити свій фенотип на Cel+. Найбільш продуктивні штами були ізольовані з культур, в яких спонтанне утворення Cel--фенотипу відбувалося з мінімальною частотою, яку майже неможливо виявити. Ймовірність утворення Cel--фенотипу підвищується під дією хімічного мутагенезу K.xylinus. Більша частина цих мутацій не знаходиться у структурних генах, що відповідають за біосинтез целюлозию [15]. Тимчасова неможливість синтезувати целюлозу була помічена у штамах дикого типу (wild-types trains) K.xylinus під час їх культивації у середовищі з мінімальним вмістом поживних речовин [16]. Ці спостереження можуть вказувати на те, що синтез целюлози в диких штамах K.xylinus може регулюватися за принципом «увімкнути-вимкнути». Однак, цей процес досі лишається маловивченим.

Agrobacterium tumefaciens. Це вільноіснуючий у ґрунті організм. Бактерія вважається рослинним патогеном, оскільки вона може утворювати пухлини під час інвазії в рослинні клітини.

Культура може синтезувати целюлозу з різноманітних субстратів. Цей процес асоційований з флокуляцією (утворення пухких агрегатів або флокул невизначеної форми з дрібних частинок дисперсної фази, які знаходяться в завислому стані в рідкому чи газовому середовищі) [17].

Попри схожість організмів у метаболізмі, кінцевий результат різний. Якщо у K.xylinus діє більш удосконалений механізм організації фібрил, що призводить до утворення міцної плівки, то A.tumefaciens синтезує короткі пучки та флокули [18].

Синтез целюлози в цьому організмі переважно стосується його патогенності, оскільки на перших етапах зараження рослини A.tumefaciens синтезує целюлозні фібрили, щоб оточити поверхню рослинної клітини, сприяючи прикріпленню до неї. Отже, головна роль целюлози тут полягає у тому, аби міцно прикріплятися до великої кількості клітин-хазяїна, сприяючи утворенню пухлини [19].

Целюлоза для бактерій з роду Rhizobia. Також слугує інструментом прикріплення до рослинних клітин. Проте утворені симбіотичні відносини між бактерією та рослиною мутуалістичні, а не паразитичні. Бактерії Rhizobia асоційовані з корінням бобових рослин, формуючи специфічні бактеріальні нодули. У цьому симбіозі бактерії забезпечують рослину азотом (оскільки здатні фіксувати атмосферний азот), а рослина бактерії – мінеральними речовинами.

Організми можуть вільно існувати у ґрунті або заселяти коріння рослин з високою специфічністю. Про це свідчать навіть видові назви, які складаються з родової (Rhizobium) та видової назви рослини, з нодул якої вони були виділені. Як і Agrobacterium, представники Rhizobium синтезують короткі целюлозні фібрили [20].

• Культура Sarcina ventriculi – грам-позитивного анаеробного організму, який живе у ґрунті. Здатна синтезувати целюлозу, що відіграє роль «цементу» для клітин. Вона не потребує специфічного рівня рН, може рости як за рН=2, так і за рН=10. Тут вона допомагає поживним речовинам розповсюджуватися із субстрату до клітин. Проте особливість фізіології S.maxima зумовлює толерантність до кислого та лужного середовищ
і без целюлозного шару. Тож малоймовірно, що целюлоза спричиняє подібну стійкість [21]. Таки, роль целюлози для цього організму досі не встановлена.

• Інші представники: Achromobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Pseudomonas. Синтезують целюлозні фібрили для флокуляції у стічних водах [22].


Фізичні характеристики: чим відрізняється від рослинної целюлози?

Кристалографічна форма бактеріальної целюлози дійсно дуже схожа на рослинну, що й дозволяє робити припущення щодо її використання у целюлозно-паперовій промисловості. Причому її властивості потенційно можуть покращити паперові вироби (наприклад, виготовлення вогнестійкого паперу). На рисунку 3 можна побачити структуру бактеріальної целюлози:
Рис.3. Структура ліворуч — бактеріальні фібрили, праворуч — деревні волокна // Wienhua Gao, Wenjia Han "Properties of Bacterial Cellulose and its Influence on the Physical Properties of Paper," BioResources 6, no. 1 (2011): 146.
Незважаючи на схожість кристалографічної форми, морфологія бактеріальної целюлози відрізняється від рослинної. Як показано на рисунку, бактеріальні фібрили сплутані, а на їх поверхні знаходиться велика кількість малих філаментів. Бактеріальні волокна коротші за деревні, проте бактеріальна целюлоза не «розпадається» на окремі фібрили, а формує волокнисті стрічки, поверхня яких вкривається більш дрібними «волокнами». Така ширина розподілу бактеріальних фібрил робить їх схожими на деревні. Схожість бактеріальної та рослинної целюлози доводить і Фур'є-ІЧ-спектрометр.

Чи повинно бути щось, що б відрізняло цих два матеріали? Термогравіметричний аналіз виявив, що бактеріальна целюлоза має менше домішок та компактнішу ультра-структуру, ніж рослинна. Завдяки цьому рослинні волокна простіше зруйнувати термічним впливом.

Бактеріальна целюлоза може викликати великий комерційний інтерес. Це легкий матеріал, який може сполучатися з іншими речовинами (згідно з дослідженням В. Гао та ін., бактеріальна целюлоза покращила властивості традиційного паперу) [23]. Такі спеціальні властивості бактеріальних волокон беруть початок зі внутрішньої ультра-структури. Цей матеріал має значний потенціал у паперово-целюлозній промисловості, проте через високу вартість його використання обмежене. Подальші дослідження цього процесу на молекулярному рівні разом із розробкою нових технологій ферментації значно підвищать доступність продукту на ринку.



БІБЛІОГРАФІЯ

1. Parmjit Panesar, Manab Bera, Yogita Chavan and Harish Chopra, "Evaluation of Acetobacter Strain for the Production of Microbial Cellulose," Asian Journal of Chemistry 21, no. 10 (2009): 1.

2. Makoto Shoda, Yasushi Sugano, "Recent advances in bacterial cellulose production," Biotechnology and Bioprocess Engineering 10, no. 1 (2005): 1.)

3. Phashant Chawla, Ishwar Bajaj, Shrikant Survase, Rekha Singhal, "Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications," Food Technology and Biotechnology 47, no. 2 (2009): 107-108.

4. Phashant, «Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications», 108.

5. Makoto Shoda, Yasushi Sugano, «Recent advances in bacterial cellulose production», 2.

6. Moshe Benziman and Baruch Rivetz, «Factors Affecting Hexose Phosphorylation in Acetobacter xylinum,» Journal of Bacteriology 111, no. 2 (1972): 328.

7. Stanisław Bielecki and Alina Krystynowicz, «Bacterial Cellulose,» Polysaccharides and Polyamides in the Food Industry 5 (2005): 45-46.

8. M. Schramm, Z. Gromet, S. Hestrin, «Synthesis of Cellulose By Acetobacter xylinum: Substrates and Inhibitors», Biochemical Journal 67, no. 4 (1957): 677.

9. Haim Weinhouse, Moshe Benziman «Role of Hexose Phosphate in Synthesis of Cellulose by Acetobacter хylinum», Nature 179 (1957): 539.

10. Gary Heberlein, J. De Ley, R. Tutgat «Deoxyribonucleic Acid Homology and Taxonomy of Agrobacterium, Rhizobium, and Chromobacterium», Journal of Bacteriology 94, no. 1 (1967): 119-120.

11. M. Schramm, S. Hestrin, "Factors affecting Production of Cellulose at the Air/ Liquid Interface of a Culture of Acetobacterxylinum," Journal of General Microbiology 11, no. 1 (1954): 124.

12. Scott Williams and Robert Cannon, "Alternative Environmental Roles for Cellulose Produced byAcetobacter xylinum," Applied and Environmental Microbiology 55, no 10 (1989): 2449.

13. Kathryn Cook and Ross Colvin, "Evidence for a Beneficial Influence of Cellulose Production on Growth Of Acetobacter xylinum in Liquid Medium," Current Microbiology 3, no. 4 (1980): 204-205

14. Schramm, "Factors affecting Production of Cellulose at the Air/ Liquid Interface of a Culture of Acetobacterxylinum", 124.

15. Svein Valla, Jons Kjosbakken, "Cellulose-negative Mutants of Acetobacter xylinum," Journal of General Microbiology 128 (1982): 1401.

16. Williams, "Alternative Environmental Roles for Cellulose Produced by Acetobacter xylinum", 2450.

17. Maria Deinema, M. Zevenhuizen, "Formation of Cellulose Fibrils by Gram-negative Bacteria and Their Role in Bacterial Flocculation," Archives of Microbiology 78, no. 1 (1971): 42.

18. Robin Gurlitz, Patricia Lamb, Ann Matthysse, "Involvement of Carrot Cell Surface Proteins in Attachment of

19. Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiology 83, no. 1 (1987): 564.

20. Ann G. Matthysse, "Role of Bacterial Cellulose Fibrils in Agrobacterium tumefaciens Infection," Journal of Bacteriology 154, no. 2 (1983): 906.

21. Weinhouse, "Role of Hexose Phosphate in Synthesis of Cellulose by Acetobacter хylinum", 539.

22. Canale-Parola "Biology of the Sugar-Fermenting Sarcinae," Bacteriological Reviews 34, no. 1 (1970): 85-91.

23. Gao, "Properties of Bacterial Cellulose and its Influence on the Physical Properties of Paper," 148-149.