ПРОТОТИП БІОРЕАКТОРА ДЛЯ СИНТЕЗУ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ЦЕЛЮЛОЗИ. ЕТАП І

Юлія Удовенко
дослідниця-мікробіологиня
науковий керівник: В'ячеслав Пономарчук
кандидат біологічних наук
Йдеться про синтез із залученням мікроорганізмів, у тому числі – бактерій.
Вперше здатність мікроорганізмів синтезувати целюлозу описав Андріан Браун у 1886 році на прикладі Acetobacter xylinum (нині – Komagataeibacter xylinus) [3]. До мікроорганізмів з подібною здатністю належать також деякі види грибів (ооміцети), водоростей (бурі, червоні та золотисті водорості) та бактерій [4]
Komagataeibacter xylinus, Acetobacter xylinoides, Bacterium gluconicum, Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [7]
Schizosaccharomyces pombe, Saccharomycodes ludwigii, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailli, Brettanomyces bruttanomyces, B.bruxellensis, B.lambicus, B.custersii, B.pichia, представники родів Candida, Torulopsis, Pichia, Kloeckera [8], [9]
Уявіть собі, що ми живемо в ідеальному світі: у людей є чисті повітря та вода, якісні їжа та медицина, надсучасні технології та eco-friendly виробництво. Впевнена, кожен з нас не відмовився від такого безтурботного життя, але реалії ХХІ століття жахають. Згідно даних ООН площа лісового покриву Землі продовжує скорочуватися з 4.1 млрд. га у 2000 році до близько 4 млрд. га у 2015 році (з 31,2% до 30,7% поверхні суші) [1]. Таке скорочення деревної сировини вірогідно матиме катастрофічні наслідки щонайменше тому, що рослини – джерело нашого харчування та продуктів загального вжитку: паперу, тканин, біопалива. А зі збільшенням людської популяції буде збільшуватися й попит на ці продукти. За підрахунками FAO у 2010 році кількість вилученої деревини сягнула 3.4 млрд м3. Очікується, що у 2050 році це значення збільшиться втричі [2]. Саме через деградацію природних екосистем треба шукати інший спосіб виробництва целюлози та целюлозних матеріалів, аби садок вишневий коло хати не перетворився на черговий журнал. Серед наявних альтернативних методів синтезу целюлози вже є декілька комерційно привабливих варіантів: вирощування генетично модифікованих деревних рослин, оптимізація технологій у картонно-паперовій промисловості, мікробіологічний синтез (*). Останній метод лежить в основі мого дослідження. Мета цього експериментально-дослідницького проекту полягає у створенні прототипу біореактора зі стабільною та високопродуктивною культурою продуцентів целюлози, принцип роботи якого дозволить знизити вартість виробництва кінцевого продукту.

Найбільш екологічний та швидкий спосіб отримання целюлозних матеріалів – використання мікроорганізмів у якості «міні-фабрик» з виробництва цього полімеру (*). Цей метод не вилучає біомасу з природних екосистем у порівнянні з традиційними вирубуванням деревини. Ще одна перевага методу полягає у відносній швидкості отримання кінцевого продукту (целюлози), оскільки час розмноження мікроорганізмів значно менший за час розмноження та розвитку навіть генетично модифікованих рослин. Сам кінцевий продукт має ряд фізико-хімічних переваг. Бактеріальна целюлоза, на відміну від рослинної, не має домішків (таких як лігнін або геміцелюлоза), має вищий ступінь кристалічності та полімеризації, більшу міцність [5]. Ці фактори, відповідно до позицій сталого розвитку, роблять метод все більш перспективним. Однак, наразі використання у промисловості бактеріальної целюлози обмежене через високу вартість – 30$ за кілограм проти 2$.


Проект розбитий на декілька етапів.
  1. Я почала з пошуку теоретично можливих продуцентів целюлози, а також аналізу біологічних особливостей обраних «кандидатів». Виявилося, що серед них саме Komagataeibacter xylinus вважається одним з найбільш продуктивних видів [6]. Детальніше про механізм синтезу бактеріальної целюлози можна прочитати у додатку.

  2. Тож я зупинилася на бактерії K.xylinus, чисту культуру якої отримала з симбіозу оцтовокислих бактерій та дріжджів. Вивчення метаболічних процесів дозволило визначити оптимальні умови для розвитку обраної культури (поживне середовище та фізико-хімічні параметри) та перейти до культивування мікроорганізму у лабораторних умовах. Для більш детального вивчення об'єкта я застосувала світлову мікроскопію. Зараз я знаходжуся саме на цій стадії проекту.

  3. Наступний крок: виявити, чи відіграють дріжджі або бактерії роду Acetobacter якусь роль у процесі синтезу целюлози (формуванні целюлозної плівки). Далі тестуватиму монокультури або мікробіологічний симбіоз на дослідних субстратах.

  4. Кінцевий бажаний результат цього дослідження – прототип біореактора.


Практичний етап розробки

У якості джерела потрібної культури використовую симбіоз молочнокислих, оцтовокислих бактерій (*) та дріжджів (*). Цей симбіоз відомий як чайний гриб або Medusomyces gisevii J. Lindau. На макрорівні він складається з двох частин: плавучого шару целюлозної плівки та рідкого середовища. Якщо хтось намагався виростити цей чудернацький організм, то міг спостерігати, що целюлозна плівка через деякий час інкубації піднімається догори. Що викликає відділення шару целюлози від загальної рідини? У проміжку між плівкою целюлози та шаром дріжджів накопичується вуглекислий газ, який утворюють дріжджі у процесі анаеробного перетворення цукрів на молекули етанолу (спиртове бродіння) [10]. «Вбудовані» у целюлозний матрикс, оцтовокислі бактерії отримують тісний контакт з атмосферним повітрям, який необхідний для протікання життєво важливих процесів. Дріжджі у цей час отримують енергію анаеробно, утворюючи спирт, який у своїх метаболічних шляхах використовують ті ж оцтовокислі бактерії (далі – ОКБ). Тож таке вертикальне розділення має цілком обґрунтовану біологічну причину.

Я використала саме чайний гриб через простоту вирощування та досить високу швидкість формування бактеріальної целюлози. Для культивування M. gisevii ми розчинили 5,4% г/мл сахарози та додали 0,2% г/мл чорного чаю до гарячої питної води. Розчин настоювали протягом 15 хвилин, а потім процідили через фільтрувальний папір. Температура готового розчину дорівнювала 25℃±3℃. Після досягнення необхідної температури до нього додали зрілу культуру гриба та культуральну рідину (V=10-20 мл). Скляна банка з розчином та чайним грибом була закрита марлевою тканиною (див. Рис. 1, перший зразок).
Рис.1. Моніторинг зразків з M. gisevii // Юлія Удовенко ©️
Процес ферментації відбувався при кімнатній температурі у темряві та статичних умовах протягом двох тижнів. За 14 діб процедуру повторили, оскільки у першому дослідному зразку поживні речовини субстрату почали вичерпуватися і через активне розмноження колонії дріжджів поверхня біоплівки вкрилася бульбашками вуглекислого газу. Ферментація у другому зразку через невелике збільшення температури зберігання тривала 9 діб (див. Рис.1, другий зразок), після чого був створений третій зразок. У ньому бактеріальна плівка утворилася на 4 добу, і вона була вилучена зі зразка для подальших досліджень.

Ці досліди дозволили мені визначити види мікроорганізмів (а саме K.xylinus), які представлені у досліджуваних зразках. Як інокулят будемо використовувати культури третього та другого зразків (перші п'ять та останні п'ять чашок Петрі відповідно). Задля отримання стабільної культури рН поживного середовища буде у межах від 5 до 6,5, а температура середовища не буде перевищувати 28-30℃ – згідно з «Визначником бактерій Берджі» ці показники є оптимальними для культивування.

Зазвичай для успішного ізолювання більшості видів ОКБ використовують стандартне поживне середовище GYC (Glucose Yeast Carbonate). У цьому середовищі глюкоза є джерелом вуглецю та енергії, дріжджовий екстракт – джерелом вітамінів, особливо групи В, а кальцій карбонат – буфером, який нейтралізує кислоти, що утворюються у процесі метаболізму ОКБ. Тому бактерії при рості на GYC утворюють чисті ділянки або ореоли саме навколо часточок CaCO3.

Для приготування GYC на 500 мл дистильованої води ми використовували 25,0 г D-глюкози, 5,0 г екстракту дріжджів, 2,5 г кальцію карбонату та 10,0 г агару (див. Рис.2).
Рис. 2. Приготування поживного середовища // Юлія Удовенко ©️
Приготовану суміш асептично розлила у чашки Петрі (n=10). У кожній чашці знаходилося 20 мл середовища. Зразки залишили у сухоповітряному термостаті TC-80 при температурі 30℃.
Рис 3. Проведення посіву на щільне поживне середовише // Юлія Удовенко ©️
За 24 години інкубації в усіх чашках Петрі, окрім зразків № 8, 9 та 10, з'явилися матові колонії білуватого кольору та глянцеві колонії кремового кольору, які я попередньо визначила як представників родів Saccharomyces та Lactobacillus (див. рис. 4).
Рис 4. Результати посіву на середовище GYC (24 години інкубації)// Юлія Удовенко ©️
За 72 години інкубації з'явилися колонії помаранчевого кольору, а подекуди поверхня поживного середовища мала темно-помаранчевий (бурий) колір
Рис. 5 Колонії мікроорганізмів після 72 години інкубації // Юлія Удовенко ©️
Під час забору бактеріологічного матеріалу виявила, що зміна кольору у зразку № 6 була спричинена появою плівки бурого кольору
Рис. 6 Поява бурої плівки у зразку № 6 // Юлія Удовенко ©️
З'ясувати природу плівки мені допоміг метод світлової мікроскопії. Мікроскопіювання цього об'єкту проводилося за допомогою світлового тринокулярного мікроскопу SIGETA MB-303 40x-1600x LED Trino при його збільшенні у 64, 640 та 1600 разів. У досліджуваній плівці були виявлені паличкоподібні бактерії, які були визначені як K.xylinus.
Рис. 7 Мікроскопіювання об'єкту. Перше знайомство з головним об'єктом дослідження де-факто // Юлія Удовенко ©️
ПІДСУМКИ


Основними завданнями для мене на цьому етапі дослідження були визначення, вивчення та виділення об'єкту подальших досліджень. Я зупинилася на бактерії K.xylinus, чиста культура якої виділилась з симбіозу оцтовокислих бактерій та дріжджів (чайний гриб). Аналіз теоретичного матеріалу дозволив мені обрати необхідне середовище (середовище GYC) та підібрати оптимальні фізичні параметри для вирощування мікроорганізмів. Як наслідок, при використанні методу світлової мікроскопії вдалося більш детально вивчити об'єкт дослідження. Власні спостереження та дані наукових досліджень дають підстави припустити, що біологічна мета формування целюлози полягає у забезпеченні твердої поверхні, на якій «вбудовані» клітини-аероби можуть отримувати вигоду від тісного контакту з атмосферою [11]. Це явище можна спостерігати як на макрорівні (у моєму випадку на прикладі вирощування Medusomyces gisevii J. Lindau, або ж чайного гриба), так і на мікрорівні.

У наступній статті я продовжу працювати з культурою K.xylinus, а для проведення першого експерименту шукатиму ще й представників роду Acetobacter. Stay tuned.




БІБЛІОГРАФІЯ :

  1. Lois Jensen (ed.), "Goal 15: Protect, restore and promote sustainable use of terrestrial ecosystems, sustainably manage forests, combat desertification, and halt and reverse land degradation and halt biodiversity loss," The Sustainable Development Goals Report 2018 (2018): 28-29.

  2. Rod Tailor, «Forests and wood products,» WWF Living Forests Report 4 (2012): 2-16.

  3. Adrian J Brown, "On an Acetic Ferment Which Forms Cellulose", Journal of the Chemical Society 49, no.43 (1886): 432.

  4. Xiang Zhang, Science and Principles of Biodegradable and Bioresorbable Medical Polymers (Cambridge: Woodhead Publishing, 2017), 301.

  5. Makoto Shoda, Yasushi Sugano, "Recent advances in bacterial cellulose production", Biotechnology and Bioprocess Engineering 10, no. 1 (2005): 1.

  6. Phashant Chawla, Ishwar Bajaj, Shrikant Survase, Rekha Singhal, "Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications", 107.

  7. N. O. Kozyrovska, O. M. Reva, V. B. Goginyan, J.-P. de Vera, "Kombucha microbiome as a probiotic: a view from the perspective of post-genomics and synthetic ecology", Biopolymers and Cell 28, no. 2 (2012): 104.

  8. Ai Leng Teoh, Gillian Heard , Julian Cox, "Yeast ecology of Kombucha fermentation", International Journal of Food Microbiology 95, no. 2 (2004): 119-120.

  9. [1] Caili Fu, Fen Yan, Zeli Cao, Fanying Xie, Juan Lin, "Antioxidant activities of kombucha prepared from three different substrates and changes in content of probiotics during storage," Food Science and Technology 34, no. 1 (2014): 123.

  10. C. Chen, B.Y. Liu, "Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation", Journal of Applied Microbiology, no. 89 (2000): 838.
  11. Kathryn Cook and Ross Colvin, "Evidence for a Beneficial Influence of Cellulose Production on Growth Of Acetobacter xylinum in Liquid Medium", Current Microbiology 3, no. 4 (1980): 204-20