ПРОТОТИП БІОРЕАКТОРА ДЛЯ СИНТЕЗУ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ЦЕЛЮЛОЗИ. ЕТАП ІІ

Юлія Удовенко
дослідниця-мікробіологиня
науковий керівник: В'ячеслав Пономарчук
кандидат біологічних наук
Подібний антропогенний вплив має далекострокові наслідки, які виливаються у дещо більше, ніж просто скорочення біорізноманіття: зменшення вмісту кисню у повітрі, зміна клімату, опустелювання.
Деревина містить лігнін та геміцелюлозу, від яких на виробництвах позбавляються для отримання чистої целюлози
Експеримент №2 наслідуватиме ту ж мету, проте у якості дослідних мікроорганізмів ми використаємо бактерії. Його я планую провести згодом
Проект розбитий на декілька етапів.

  1. Я почала з пошуку теоретично можливих продуцентів целюлози, а також аналізу біологічних особливостей обраних «кандидатів». Виявилося, що серед них саме Komagataeibacter xylinus вважається одним із найбільш продуктивних видів. Детальніше про механізм синтезу бактеріальної целюлози можна прочитати у додатку. Я отримала чисту культуру K.xylinus із симбіозу оцтовокислих бактерій та дріжджів M.gisevii (чайний гриб). Вивчення метаболічних процесів цього організму дозволило визначити оптимальні умови для розвитку обраної культури (поживне середовище та фізико-хімічні параметри) та перейти до культивування мікроорганізму у лабораторних умовах. Для більш детального вивчення об'єкта я застосувала світлову мікроскопію. Детальне висвітлення цього етапу можете прочитати тут.

  2. Наступний крок — виявити, чи відіграють дріжджі або бактерії якусь роль у процесі синтезу целюлози (формуванні целюлозної плівки). Саме на цьому етапі перебуває моє дослідження зараз.

  3. Далі тестуватиму монокультури або мікробіологічний симбіоз на дослідних субстратах.

  4. Кінцевий бажаний результат цього дослідження — прототип біореактора.


Чому саме бактеріальна целюлоза?


Масове знищення лісових екосистем заради отримання деревини — одна з найбільш серйозних проблем промисловості*. Вирішити таку проблему можуть технології, які створюють альтернативу деревним матеріалам. Найкраще роль «non wood» матеріалу виконує саме бактеріальна целюлоза: за механіко-хімічними характеристиками вона навіть перевершує деревину. Бактеріальна целюлоза не містить хімічних домішків*, має більшу міцність, пористість та водоутримуючу здатність. Такі якості відкривають цьому матеріалу великі перспективи використання у різних індустріях: від паперово-целюлозної до фармацевтичної, від харчової промисловості до нанотехнологій. Проте використання цього матеріалу лімітоване високою вартістю його виробництва. Саме на вирішення цієї проблеми спрямоване моє дослідження. Весь експериментально-дослідницький процес підпорядковується одній меті — створити прототип біореактора зі стабільною та високопродуктивною культурою продуцентів целюлози, принцип роботи якого дозволить знизити вартість виробництва кінцевого продукту.



ЕТАП ІІ

На цьому етапі нас цікавить запитання: «Чи дійсно симбіотичні відносини підвищують вихід целюлози?». Цей етап розділений на дві частини. У першій ми проводимо експеримент №1, результати якого підтвердять або спростують висунуту гіпотезу про те, що додавання дріжджів Brettanomyces bruxellensis та Saccharomyces cerevisiae позитивно впливає на кінцеву масу целюлозних плівок. Експеримент продемонструє, чи можемо ми у якості фактору, що підвищує вихід целюлози, використовувати вищевказані організми чи ні*.



ХІД ЕКСПЕРИМЕНТУ

Виділення чистих культур


Подальший план експерименту №1:

1) отримуємо чисту культуру Komagataeibacter xylinus;

2) виділяємо чисті культури B. bruxellensis та S. cerevisiae;

3) здійснюємо пересів отриманих організмів на рідке поживне середовище (чайний екстракт);

4) отримуємо вихідні дані (маса целюлозних плівок у вологому та сухому стані);

5) на основі масових значень отриманих целюлозних плівок за U-критерієм Манна-Уїтні розраховуємо достовірність різниць між вибірками.


Лабораторне дослідження знову почалося з підготовки поживного середовища GYC (Glucose Yeast Carbonate), яке використовується для культивування оцтовокислих бактерій. Я підготувала 5 чашок Петрі. У кожну з них висівала матеріал з плівки бактеріальної целюлози, яка попередньо вирощувалася протягом 6 діб (рис.1).
Рис.1. Висів мікроорганізмів-симбіонтів M.gisevii на щільне поживне середовище
// Юлія Удовенко ©️
Через декілька днів у чашках Петрі я спостерігала ріст різноманітних колоній. У першу чергу, під «мікробіологічним прицілом» знаходився об'єкт дослідження — K.xylinus. Також шукала й дріжджі — B. bruxellensis та S. cerevisiae (для висіву на рідке середовище використовували сухі хлібопекарські дріжджі).

Продуцент знайшовся одразу, утворивши на поверхні поживного агару целюлозну плівку, а B. bruxellensis відрізнявся з-поміж інших наявністю гладких колоній білого кольору. Визначивши необхідні організми, я провела їх пересів на інше поживне середовище, аби отримати чисті культури. І так, нам це вдалося (рис.2).
Рис.2. Колонії B.bruxellensis (ліворуч) та K.xylinus (праворуч) // Юлія Удовенко ©️
Пересів дослідних організмів у рідке середовище

Готуємо субстрат для отриманих організмів. Технологія виготовлення була така ж, як і у попередньому дослідженні, проте у ємності для вирощування бактерій знаходилося не 1 л. субстрату, а 0,2 л. Виготовлений чайний екстракт я розділила на 18 банок. Ці зразки поділила на 3 групи: у перших 6 банках знаходилися монокультури K.xylinus (контроль), наступні 6 банок містили культуру K.xylinus та S. cerevisiae, а останні — поєднання K.xylinus та B.bruxellensis. Дослідні зразки залишила за кімнатної температури (t=20°C) (рис.3).
Рис.3. Проведення експерименту №1 (моніторинг зразків) // Юлія Удовенко ©️
Результати дослідження

Моніторинг зразків відбувався протягом 14 днів. Після цього я вилучила утворені целюлозні плівки із субстратів для подальшого аналізу (рис.4).
Рис.4. Результати експерименту //
Юлія Удовенко ©️
Целюлозні плівки зважила спочатку у вологому стані (рис.5). Плівки з першої групи, де зростали тільки монокультури K.xylinus, мали чітку форму та однорідний колір, були щільними, гладкими, мали більшу масу (mсер = 22,13 г). Зразки з групи №2 мали меншу масу (mсер = 9,52 г), були більш тонкими, мали неоднорідний колір. Плівки з групи №3 мали найменшу масу (mсер = 6,15 г), деякі зразки мали не чітку форму.
Рис.4. Результати експерименту //
Юлія Удовенко ©️
Ці зразки висушувалися за кімнатної температури протягом 7 діб. Після цього відбулося повторне зважування плівок. Отримані дані я занесла у таблицю 1 для проведення статистичного аналізу.
Статистичний аналіз та інтерпретація даних

Оскільки емпіричні значення сухої ваги у вибірках не задовольняють нормального розподілу, то для оцінювання відмінностей між двома вибірками був використаний непараметричний U-критерій Манна-Уітні (таблиця 2). Обчислення проводилися за допомогою програмного пакету «Microsoft Excel».

Значення мас бактеріальних плівок із групи №1 (контроль) та групи №2 (K.xylinus+S.cerevisiae) розташувала в один ряд та проранжувала. Ранги значень у групі №1 та групі №2 просумувала та визначила, яка з рангових сум є більшою.

Згідно із формулою 1.1. визначила емпіричне значення Uемп (числове значення критерію):


Uемп = n1*n2 + nx(nx+1)/2+ Tx (1.1)


де n1 - кількість зразків у групі 1;
n2 - кількість зразків у групі 2;
nx - кількість зразків у групі із більшою ранговою сумою;
Tx - більша з двох рангових сум.

З визначеним рівнем статистичної значущості (U0,05) знайшли критичне значення критерію Манна-Уітні та порівняли його з емпіричним значенням. Аналогічні дії провели з групою №1 (контроль) та групою №2 (K.xylinus+B.bruxellensis).

Якщо Uемп>Uкр (0,05), то приймається нульова гіпотеза H0 (рівень ознаки у групі 2 не нижче від рівня ознаки у групі 1). Якщо ж навпаки, то нульова гіпотеза відкидається (рівень ознаки у групі 2 нижче від рівня ознаки у групі 1). Вважається, що чим меншим є значення Uемп, тим більш ймовірно, що різниця вірогідна.
В обох випадках значення Uемп було більшим за табличне значення Uкр (0,05), тому різницю у масах бактеріальних плівок серед груп вважаємо несуттєвою. Тож додавання мікроорганізмів не грало першочергової ролі у формуванні целюлози на поверхні субстрату.



ВИСНОВОК

Цим експериментом ми підтвердили, що додавання дріжджів Brettanomyces bruxellensis та Saccharomyces cerevisiae не впливає суттєво на кінцеву масу целюлозних плівок. Проте на цьому дослідження не закінчується, а K.xylinus досі має шанс знайти свого симбіонта, з яким продукуватиме целюлозу більш ефективно.

У наступному експерименті пошук такого симбіонта буде фокусуватися саме на бактеріях. Я планую виділити представників роду Acetobacter і Lactobacillus та експериментувати з ними. Слідкуйте за новинами, аби не пропустити найцікавішого.